脂酰辅酶a:脂肪醇酰基转移酶

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脂酰辅酶a:脂肪醇酰基转移酶

时间:2019-12-31本站浏览次数:424

       

脂酰辅酶a:脂肪醇酰基转移酶

本发明提供了编码脂酰辅酶A:脂肪醇酰基转移酶(蜡合酶)的核酸序列,其中所述蜡合酶具有由脂肪醇和脂酰辅酶A底物形成蜡酯的活性。特别感兴趣的是可得自表观分子量约为33KD的jojoba胚蜡合酶的核酸序列。本发明还包括可得自蜡合酶蛋白的氨基酸和核酸序列,和这种序列提供能产生蜡酯之转基因宿主细胞的用途。

简单地说,cDNA合成的克隆方法如下所述。用SstI消化质粒克隆载体,使用末端脱氧核苷酸转移酶在所得的3’-突出粘端产生同聚物T-尾。通过寡(dA)-纤维素层析从未经消化或未加尾的质粒中分离加尾的质粒。将所得载体用作引物以合成与载体质粒的任一端共价结合的cDNA第一条链。在脱氧鸟苷三磷酸的存在下,用末端转移酶处理cDNA-mRNA-载体复合物,在cDNA链的末端产生G-尾。通过BamHI消化除去与BamHI位点邻接的多余的cDNA-mRNA-复合物,剩下一端具有BamHI粘端,另一端具有G-尾的cDNA-mRNA-载体复合物。使用具有5’BamHI粘端,限制性酶NotI,EcoRI和SstI的识别序列和3’C-尾末端的退火的合成环化接头环化此复合物。连接和修复之后,用环化的复合物转化大肠杆菌菌株DH5α(BRL,Gaithersburg,MD)以产生cDNA文库。jojoba胚cDNA库含有约1.5×106个克隆,平均cDNA插入物的大小约为500个碱基对。

为了进行脂质类别的分析,将样品上样于二氧化硅TLC板上,将板置于己烷/二乙酯/醋酸(80∶20∶1或70∶30∶2v/v/v)中展开。使用AMBIS放射性分析成像系统(AMBIS Systems公司,San Diego,CA)测定脂质类,大的蜡酯,游离的脂肪酸,脂肪醇和极性脂质之间的放射性分布。必要时,从TLC板上回收各个脂质类别以进一步分析。此分析中还使用了反相TLC系统,该系统使用的是在甲醇中展开的C18板。

由于蜡合酶是膜结合蛋白,因此需要在植物细胞中表达候选蛋白质以证实活性。电穿孔或轰击植物组织以瞬时表达对此目的是有用的。最后,需要在能产生被此酶识别之底物的植物中进行稳定地植物表达。如果用蜡合酶序列转化的靶向植物通常不含此酶的脂肪醇和脂酰酯底物,可制备植物提取物,并通过在提取物中加入蜡合酶的底物来检测蜡合酶活性。下文将更详细地讨论用蜡合酶序列转化植物宿主的构建体和方法。

1.深入分析:加入硫酸钠并旋动样品之后,除去上层的有机相,用4ml己烷/异丙醇(7∶2v/v)洗涤下层的水相。集中有机相,在氮气中蒸发至干。将脂质残留物重新悬浮于少量己烷中,通过液体闪烁计数检测等分试样中的放射性。其余的样品可用于标记类别的TLC分析,从而测定所产生蜡的总量。

另外,其它编码参与很长链的脂肪酸形成之酶的核酸序列也可用于本发明的DNA构建体中,从而在植物宿主中生产蜡酯。这种核酸序列是本领域已知的,也描述于美国专利5679881中。例如,如下列实施例所述,在植物表达构建体中联合使用了本发明的蜡合酶以及编码脂肪酸延长酶(描述于美国专利5679881中,其全文列入本文作为参考)和酰基辅酶A还原酶(描述于美国专利5403918中,其全文列入本文作为参考)的核酸序列。这种植物表达构建体可在转基因的拟南芥植物中产生蜡酯。

按实施例1B所述测定发育的胚中的蜡合酶活性。对jojoba而言,种皮被确定为抑制因子的来源,应先除去种皮,再在液氮中冷冻胚,置于-70℃下保存。

图2提供了得自第二种蜡合酶纯化方案的柱组分中蜡合酶活性的分析结果,图2A为Blue A琼脂糖层析的结果,图2B为羟基磷灰石层析的结果,图2C为Superdex 75大小排阻层析的结果。

在本发明之前,蜡合酶蛋白的核酸和氨基酸序列是未知的。因此,为了得到与蜡合酶相关的核酸序列,首先必需从可利用的来源中纯化蛋白质并至少确定其部分氨基酸序列以制备可用于分离蜡合酶核酸序列的适当探针。

在玻璃管中制备底物混合物,使用前即时加入油醇,再加至样品中,于30℃保温达1小时。通过将检测管置于冰上并立即加入0.25ml异丙醇∶醋酸(4∶1v/v)以终止检测。加入未经标记的蜡酯(0.1mg)和油醇(0.1mg)作为载体。通过Hara和Radin(分析生物化学(1978)90:420)的小规模方法提取脂质。在终止反应的检测管中加入2ml己烷/异丙醇(3∶2,v/v),旋动样品,加入1ml硫酸钠水溶液(6.6%w/v),再次旋动样品。

图2提供了得自第二种蜡合酶纯化方案的柱组分中蜡合酶活性的分析结果,图2A为Blue A琼脂糖层析的结果,图2B为羟基磷灰石层析的结果,图2C为Superdex 75大小排阻层析的结果。




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